摘要：为了研究胞质分裂过程中子细胞表面张力与细胞间桥变形之间的联系，采用微管吸吮实验测定了正常大鼠肾上皮细胞(NRK)在细胞松弛素D(即CD)或blebbistatin作用下细胞表面张力的变化，并且采用局部施加CD的方法分析了两极子细胞表面张力非平衡状态下细胞间桥的变形曲线。研究结果认为，CD和blebbistatin均可以大幅降低细胞表面张力；整体施加blebbistatin抑制细胞主动性收缩会导致细胞间桥变形完全受到子细胞表面张力的调控，细胞间桥变形过程反映出细胞调节整体表面张力的进程。

动物细胞的胞质分裂过程伴随一系列精巧而又相对简单的细胞形态学改变。首先，细胞变圆拉长；随后在赤道板形成分裂沟并开始收缩，两极子细胞中间出现细胞间桥；最后，细胞间桥变细、断裂，生成两个子细胞。胞质分裂是一个典型的力学变形过程，与细胞皮层力学特性的改变关系紧密，细胞间桥变形的过程由分裂沟主动收缩和细胞各部分表面张力协调控制。

细胞表面张力是细胞皮层力学的一个重要参数，可能是肌动—肌球蛋白相互作用的结果。研究表明：完整的肌动蛋白骨架系统对于张力的产生必不可少，肌球蛋白II突变的黏菌细胞表面张力较正常黏菌细胞降低70%。因此，细胞表面张力成为衡量肌动蛋白和肌球蛋白动力学变化的一个重要指标，例如肌动蛋白和肌球蛋白的浓度分布，肌动蛋白纤维排列以及肌球蛋白轻链磷酸化激活等。胞质分裂过程中，极区子细胞的表面张力与细胞间桥变形的联系是胞质分裂动力学的重要研究对象，对探索胞质分裂的机制具有积极作用。

本文利用双微管局部加药手段通过施加细胞松弛素D抑制单侧极区子细胞皮层肌动蛋白的装配从而改变子细胞表面张力。实验中采用肌球蛋白II的ATP酶活性抑制剂blebbistatin抑制细胞的主性动收缩，在对比不同驱动力作用下细胞分裂沟间桥变形的基础上，分析了极区皮层表面张力在不同收缩力状态下对变形过程调控的差异。通过细胞间桥变形的趋势，研究和分析了子细胞表面张力与胞质分裂细胞间桥变形的联系。

1材料与方法

1.1细胞培养

正常大鼠肾上皮细胞(Normal rat kidney epithelial cells，以下简称NRK)购于中国科学院上海细胞库，培养于DMEM高糖培养基(Hyclone公司)中，内含体积分数10%的胎牛血清(四季青公司)。在体积分数5%的CO₂、37℃恒温恒湿培养箱中培养至对数生长期，待用。

1.2整体和局部抑制剂处理

对数生长期的NRK细胞经过质量分数0.25%胰酶消化5 min后轻轻吹打至悬浮。分别采用抑制肌动蛋白聚合的2μmol/L CD、抑制肌球蛋白II的ATP酶活性抑制剂30μmol/L blebbistatin处理细胞15 min。用没有加入骨架蛋白抑制剂的细胞作为对照组。

先将(—)-blebbistain对映体(Sigma公司)溶于二甲基亚砜(DMSO)中，配置成10 mmol/L的blebbistatin溶液，再加入三蒸水配成5 mmol/L储存液，—20℃保存。使用时用DMEM培养液进行稀释至终浓度为30μmol/L，内含体积分数0.3%的DMSO。利用blebbistatin处理细胞15～20 min后开始局部施加抑制剂。将CD(Sigma公司)配成100μmol/L的储存液，内含体积分数0.5%的DMSO，—20℃保存。使用时用含0.5 g/L罗丹明荧光素(Sigma公司)的DMEM培养液进行稀释，使用浓度为5μmol/L，约含体积分数0.02%的DMSO。

将抑制剂注入加药微管，加药微管直径约3μm，吸药管直径约30μm，两管相距约30μm。通过气泵调节压力，控制药物作用范围直径约15μm。加药管靠近子细胞一端极区，以避免加入的抑制剂流入分裂沟处。加入CD的范围和浓度变化可以通过罗丹明荧光素显示，荧光强度的变化代表抑制剂作用浓度梯度，施加的抑制剂在距离中心15μm以外的范围浓度很低，见图1。

图1局部施加抑制剂的范围和浓度变化

1.3细胞表面张力的测定

采用芬兰Kibron公司生产的Delta-8全自动高通量草莓污污污视频对细胞膜表面张力进行间接评估。该仪器基于朗缪尔单层原理，通过测量气液界面吸附膜的平衡表面压力来反映膜材料的表面张力特性。

样品准备与测量：

对数生长期的NRK细胞经质量分数0.25%胰酶消化后，收集细胞并用PBS洗涤两次。通过细胞计数调整细胞密度，制备成单细胞悬液。将含有细胞骨架蛋白抑制剂（CD、blebbistatin或其组合）的处理组细胞悬液及未经处理的对照组细胞悬液分别上样至仪器样品板。

测量过程：

仪器自动监测气液界面的表面压力变化。细胞在界面处发生吸附并形成单层膜，其膜脂与皮层蛋白的力学特性会影响界面的平衡表面压力（π平衡）。细胞膜的表面张力（γ细胞膜）可通过公式γ细胞膜=γ_0-π平衡进行估算，其中γ_0为纯培养基的表面张力（约为72 mN/m）。仪器自动记录达到平衡后的表面压力值，每组实验重复至少6次。

1.4细胞间桥的测量和细胞间桥动力学模型

定义间桥直径与间桥长度相等时刻的相对直径为1，其它各时刻的相对直径等于各时间点间桥直径与上述直径绝对值的比，对间桥直径进行无量纲化。规定间桥直径与间桥长度相等时的时刻为0 s，则所有曲线均过(0,1)点，定义(0,1)点为D₀(见图2)，使曲线更具有直观性和可比性。对表观速度进行如下规定：D₀之前的表观速度为间桥直径在-200~0 s时间段的速度；D₀之后的表观速度为间桥直径在0～200 s时间段的速度。

图2 NRK细胞形态学参数随时间变化曲线

实验采用间桥变细动力学模型对间桥变形进行分析和模拟，见图3。该模型认为：肌球蛋白II所产生的径向应力为主动力，促进胞浆从间桥向两个子细胞流动；间桥末端以及子细胞胞浆黏性产生的轴向应力为被动力，阻碍胞浆从间桥向两个子细胞流动。间桥半径随时间变化的函数表达式为：

1.5数据采集与统计学分析

用微管吸吮测量细胞表面张力，采用100倍物镜，10倍目镜；对细胞形态变形进行测量实验，采用40倍物镜，10倍目镜，两者均通过中继放大50%。图像采集均通过冷CCD(DP71，Olympus)进行图像采集，间隔4 s取像。采用图像处理软件(Image Pro 5.1，Olympus)进行形态学测量。不同细胞组数据用OriginPro 8.0处理，用SPSS 13.0统计分析软件及方差分析比较组间差异，P<0.05，有统计学意义。数据均以均数±标准差表示。