1.4生物表面活性剂的提取、鉴定和临界胶束浓度测定

取培养72 h的细菌发酵液在4℃、5000×g离心30 min，取上清液用1 mol·L-1HCl调节pH为2.0，然后加入等体积的三氯甲烷/甲醇（2∶1，V∶V）混匀，萃取三次合并有机相，用无水硫酸钠干燥后，45℃旋转蒸发除去有机溶剂，得到浅黄色浆状物，即为生物表面活性剂粗产物。

薄层色谱：取0.2 g提取的上述粗产物溶于1 mL的氯仿中，点样于硅胶G板进行薄层色谱分析，三氯甲烷/甲醇/水（65∶15∶1，V∶V）为展开剂，用不同的显色剂显色。（1）苯酚-硫酸试剂：3 g苯酚与5 mL硫酸溶解于95 mL乙醇中，如果显棕色斑点，则有糖脂存在，反之糖脂不存在；（2）茚三酮显色剂：0.5 g茚三酮溶于100 mL丙酮中，如果斑点显红色，则有脂肽存在，反之脂肽不存在。

红外扫描分析（Fouriertransforminfraredspectrometer，FT-IR）：将生物表面活性剂粗产品溶于三氯甲烷后，在制备型硅胶薄板上进行分离，依照显色带位置刮下目的硅胶层，用三氯甲烷/甲烷（1∶1，V∶V）提取后于40℃下减压蒸干，得到部分纯化的生物表面活性剂。将上述生物表面活性剂溶于甲醇，采用KBr压片法（1～2 mg样品+200 mgKBr，干燥处理后研细），混合压成透明薄片后红外扫描分析测定。

发酵产物临界胶束浓度测定（Critical micelle concentration，CMC）：精确称取上述提取所得的产物粗品溶于蒸馏水中，配制成不同浓度梯度（0～500 mg·L-1）的产物溶液，测定溶液的表面张力，并依据表面活性剂浓度-表面张力曲线求得临界胶束浓度值。

1.5细菌发酵条件优化

1.5.1测定指标

发酵液表面张力值以吊环法测定，乳化性能采用超声体积比法测定。发酵液培养后，离心收集菌体，于105℃烘干至恒重后称重，以菌体干重表示生物量。发酵液培养后，离心收集上清液，用等体积乙酸乙酯萃取2次后，45℃减压蒸干，将残余物溶于等体积的0.05 mol·L-1NaHCO3中，以硫酸苯酚法测定糖脂含量。

1.5.2碳源对菌株生长及产生表面活性剂的影响

取150 mL三角瓶，每瓶中加入50 mL无机盐培养基，分别加入10 g·L-1的葡萄糖、甘油、花生油、可溶性淀粉、液体石蜡、麦芽糖、乳糖、蔗糖（对照组不加碳源）。3 d后分别测定发酵液的表面张力值、乳化性、生物量、糖脂含量。每个处理三次重复。

1.5.3氮源对菌株生长及产生表面活性剂的影响

以碳源实验中获得的最优碳源作为选定碳源，取10 g碳源加入1 L不含（NH4）2SO4无机盐培养基中。取150 mL三角瓶，每瓶中加入50 mL上述培养基，分别加入2 g·L-1的硝酸钠、硫酸铵、脲、硝酸铵（对照组不加氮源）。3 d后分别测定发酵液的表面张力值、乳化性、生物量、糖脂含量。每个处理三次重复。

1.5.4碳氮比对菌株生长及产生表面活性剂的影响

取150 mL三角瓶，每瓶中加入50 mL含不同碳氮源的无机盐培养基。固定氮源为2 g·L-1，分别加入已优化的碳源，控制比例为1、5、10、15、20、25、30、35、40（对照组不加氮源）。3 d后分别测定发酵液的表面张力值、乳化性、生物量、糖脂含量。每个处理三次重复。

1.5.5温度对菌株生长及产生表面活性剂的影响

取150 mL三角瓶，每瓶中加入50 mL上述已优化的无机盐培养基。控制摇床温度在15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃。3 d后分别测定发酵液的表面张力值、乳化性、生物量、糖脂含量。每个处理三次重复。

1.5.6 pH对菌株生长及产生表面活性剂的影响

取150 mL三角瓶，每瓶中加入50 mL上述已优化的无机盐培养基。控制培养基pH为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13。3 d后分别测定发酵液的表面张力值、乳化性、生物量、糖脂含量。每个处理三次重复。

1.5.7NaCl浓度对菌株生长及产生表面活性剂的影响

取150 mL三角瓶，每瓶中加入50 mL上述已优化的无机盐培养基。控制培养基NaCl浓度为0、5、10、15、20、25、30、50、80、120、160 g·L-1。3 d后分别测定发酵液的表面张力值、乳化性、生物量、糖脂含量。每个处理三次重复。

1.5.8菌株147发酵动态图

取150 mL三角瓶，每瓶中加入50 mL上述已优化的无机盐培养基。在12、24、36、48、60、72、84、96、108、120、132、144 h后分别测定发酵液的表面张力值、乳化性、生物量、糖脂含量。每个处理三次重复。

1.6生物表面活性剂对多环芳烃增溶效果

25 mL三角瓶中加入过量的苯并［a］芘、芘、荧蒽和10 mL不同浓度的生物表面活性剂粗产物溶液，然后加入0.02%的叠氮化钠抑制微生物的生长。盖好塞子并用封口膜封口后，25℃、50 r·min-1振荡48 h后，将溶液转移至离心管中5000 r·min-1离心15 min，取上清液加入等体积的二氯甲烷∶正己烷=1∶1（V∶V）萃取3次，收集洗脱液并于40℃浓缩至干，用甲醇定容到2 mL，过0.22μm孔径滤膜后HPLC分析。